常見問題

mNGS技術(shù)的(de)核心是測定核酸分(fēn)子的(de)堿基序列，除不含核酸的(de)蛋白病毒-朊病毒外，寄生蟲、真菌、細菌、非典型病原體、DNA病毒及RNA病毒均可(kě)通過NGS技術(shù)檢測。

1.      避免使用(yòng)幹擾PCR反應的(de)耗材，如(rú)肝素抗凝管。

2.      采樣時确保能(néng)采集到(dào)病原微生物(wù)所在的(de)感染部位。

3.      采樣時避免環境微生物(wù)污染。

影響。标本量的(de)多少(shǎo)決定了标本中病原微生物(wù)的(de)含量。當标本量過少(shǎo)時，标本中病原微生物(wù)的(de)含量可(kě)能(néng)低于該技術(shù)的(de)檢測限，導緻該樣本中的(de)病原微生物(wù)不能(néng)被正常檢出。

理(lǐ)論上(shàng)DNA病原體和(hé)RNA病原體可(kě)同時檢測。檢測流程需要同時對樣本中的(de)DNA和(hé)RNA進行(xíng)提取，其中RNA經過額外處理(lǐ)後變成DNA，将全部DNA進行(xíng)二代測序文(wén)庫構建，即可(kě)以實現同時對DNA病原體和(hé)RNA病原體的(de)共檢測。

核酸提取時，不同的(de)前處理(lǐ)條件(jiàn)對不同病原體的(de)核酸提取效率影響不同，如(rú)真菌類病原體需通過物(wù)理(lǐ)或化學處理(lǐ)提高(gāo)細胞壁的(de)裂解，以增加檢出，但(dàn)這些操作可(kě)能(néng)導緻RNA降解，影響RNA病毒檢出。所以需要分(fēn)别進行(xíng)處理(lǐ)再合并文(wén)庫構建和(hé)上(shàng)機測序。

如(rú)果同時檢測DNA流程與RNA流程，總數據量應爲單一檢測流程的(de)兩倍，才能(néng)維持相(xiàng)同的(de)靈敏度。（例如(rú)單一流程爲20M數據量，那麽共檢DNA和(hé)RNA的(de)流程數據量爲40M）。如(rú)果總數據量不變，就會(huì)導緻靈敏度降低。

1.      樣本中提取的(de)交叉污染、PCR擴增引起的(de)氣溶膠污染，會(huì)導緻假陽性結果，故此在臨床應用(yòng)中需要有(yǒu)嚴格的(de)實驗分(fēn)區、實驗室管理(lǐ)及質量控制(zhì)措施；

2.      樣本采集/保存、運輸及處理(lǐ)不當、未按說明(míng)書(shū)操作均有(yǒu)可(kě)能(néng)導緻假陽性或假陰性結果。如(rú)，采集樣本時未充分(fēn)消毒，可(kě)能(néng)導緻皮膚定植菌入樣本，導緻假陽性；組織樣本取樣偏離(lí)感染部位，可(kě)能(néng)導緻檢出假陰性。

3.      樣本中病原體濃度低于檢出限可(kě)能(néng)造成假陰性結果；

4.      數據量給定時，一份标本中人(rén)源背景核酸越多，微生物(wù)核酸的(de)占比越少(shǎo)，此種情況下也(yě)可(kě)能(néng)導緻假陰性。

5.      樣本本身的(de)低質量序列、物(wù)種的(de)錯誤注釋、來自于人(rén)源序列/接頭序列/載體等污染。

采用(yòng)基因組水(shuǐ)平的(de)數據庫進行(xíng)鑒定，物(wù)種鑒定準确度更高(gāo)，一定程度上(shàng)可(kě)降低假陽性和(hé)假陰性。

1.      細菌和(hé)病毒的(de)基因組較小(xiǎo)，構成不太複雜，絕大(dà)多數是完整基因組水(shuǐ)平。

2.      真菌和(hé)寄生蟲基因組大(dà)，構成複雜，組裝難度高(gāo)，大(dà)部分(fēn)處于Scaffold或Conting水(shuǐ)平。

3.      Scaffold或Conting雖不是完整基因組水(shuǐ)平，但(dàn)含有(yǒu)絕大(dà)多數基因組序列，隻有(yǒu)少(shǎo)數未知序列，可(kě)以進行(xíng)物(wù)種鑒定。

常規裂解液對細胞壁較厚的(de)胞内菌/真菌的(de)細胞壁裂解效率低，導緻核酸釋放(fàng)量較少(shǎo)，從而影響胞内菌和(hé)真菌的(de)檢出。

全基因組測序（WholeGenome Sequencing， WGS）：分(fēn)離(lí)單獨菌株，采用(yòng)WGS測序，進行(xíng)高(gāo)分(fēn)辨率分(fēn)子流行(xíng)病學，新病原體發現，毒力/耐藥基因應用(yòng)；

靶向擴增測序（Targeted amplicon sequencing）:不需培養，需要假設細菌或者真菌，鑒定細菌采用(yòng)16SRNA測序，鑒定真菌采用(yòng)真菌18SRNA測序；

紅基因組測序（metagenomic sequencing, mNGS）:不需要培養，不需要假設，無偏性檢測細菌，真菌，病毒，寄生蟲等病原。

胞外菌寄居在宿主細胞外，胞外菌感染時病菌主要位于宿主細胞外的(de)血液、淋巴液、組織液等體液中。

大(dà)多數的(de)緻病菌都(dōu)是胞外菌，主要緻病機制(zhì)是外毒素、内毒素等毒性物(wù)質引起局部化膿性炎症。常見的(de)胞外菌主要有(yǒu)葡萄球菌、鏈球菌、奈瑟菌、淋球菌、厭氧芽孢梭菌和(hé)多種革蘭氏陰性杆菌。

胞内菌分(fēn)爲兼性胞内菌和(hé)專性胞内菌。

兼性胞内菌指在宿主體内主要寄居在細胞内生長繁殖，也(yě)可(kě)在體外無細胞的(de)适宜環境中生存和(hé)繁殖，如(rú)結核分(fēn)枝杆菌、麻風分(fēn)枝杆菌、傷寒沙門菌、嗜肺軍團菌、布魯氏菌、李斯特菌等。

結核分(fēn)枝杆菌符合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTC）主要包括：結核分(fēn)枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛分(fēn)枝杆菌（Mycobacterium bovis）、非洲分(fēn)枝杆菌（Mycobacterium africanum）、卡内蒂分(fēn)枝杆菌（Mycobacterium canettii）、田鼠分(fēn)枝杆菌（Mycobacterium micro提、山羊分(fēn)枝杆菌（Mycobacterium caprae）等。

MTC屬于胞内感染菌，不易釋放(fàng)到(dào)細胞外。血漿樣本檢測的(de)是遊離(lí)核酸，其載量很低，而肺泡灌洗液、腦(nǎo)脊液等其他(tā)樣本，雖經破壁處理(lǐ)，但(dàn)相(xiàng)對于其他(tā)細菌來說，其釋放(fàng)的(de)遊離(lí)核酸仍相(xiàng)對較少(shǎo)，檢出序列數一般較低。此外，MTC的(de)種間基因組相(xiàng)似很高(gāo)，因此種水(shuǐ)平的(de)嚴格比對序列數往往爲0。

結果判斷時建議查看結核分(fēn)枝杆菌複合群水(shuǐ)平檢出情況：

1） 結核分(fēn)枝杆菌複合群水(shuǐ)平序列數≥1條，有(yǒu)一定提示意義；

2） 複合群水(shuǐ)平序列數≥3條，有(yǒu)較強提示意義；

3） 以上(shàng)均需要結合臨床及其他(tā)檢測結果等做綜合判斷。