傳統的(de)無菌标本的(de)培養是病原診斷的(de)“金(jīn)标準”[1,2]，但(dàn)其診斷的(de)敏感性遠不能(néng)達到(dào)臨床病原診斷的(de)需求。宏基因組新一代測序技術(shù)（mNGS）相(xiàng)比較傳統方法，具有(yǒu)快速，靈敏度高(gāo)的(de)優勢，可(kě)以同時檢測出一大(dà)群差異極大(dà)的(de)微生物(wù)類群，尤其可(kě)以無差别的(de)檢測出已知或未知病原和(hé)耐藥性基因信息[3,4]，顯著提升臨床病原診療效能(néng)。有(yǒu)學者預測在未來10年内，宏基因組測序将作爲常規檢測手段應用(yòng)于對病原體診療方面[5]。
在上(shàng)篇中，我們已經詳細介紹了“宏基因組學發展簡史”和(hé)mNGS檢測前注意事項，在本篇，我們将接著(zhe)介紹mNGS檢測後的(de)注意事項。
mNGS檢測後注意事項
一、mNGS檢測影響因素[6]
1. 病原體基因組大(dà)小(xiǎo)
2. 病原體生物(wù)結構
3. 樣本人(rén)源占比
二、mNGS報告解讀(dú)
1. 微生物(wù)菌種類型
明(míng)确的(de)緻病菌（低序列也(yě)需要臨床考慮）：
結核分(fēn)枝杆菌複合群、鳥分(fēn)枝杆菌、胞内分(fēn)枝杆菌、膿腫分(fēn)枝杆菌、軍團菌、諾卡菌、流感病毒、新冠病毒、曲黴、新型隐球菌、馬爾尼菲藍狀菌、組織胞漿菌、腺病毒、耶氏肺孢子菌、鹦鹉熱(rè)衣原體、肺炎支原體、呼吸道合胞病毒等等。
條件(jiàn)緻病菌（結合标本類型、序列數、微生物(wù)排名、動态變化及臨床診斷綜合判斷）：
銅綠(lǜ)假單胞菌、鮑曼不動杆菌、肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌、屎腸球菌、糞腸球菌、念珠菌、流感嗜血杆菌、嗜麥芽假單胞菌等等[6]。
常見的(de)定植菌：
（1）呼吸道：丙酸杆菌屬、棒狀杆菌屬、葡萄球菌屬、莫拉菌屬、韋榮球菌屬、鏈球菌屬、嗜血杆菌屬、梭杆菌屬、奈瑟菌屬、普雷沃菌、假單胞菌屬、卟啉單胞菌屬等；
（2）皮膚：結核硬脂酸棒狀杆菌、頭狀葡萄球菌、表皮葡萄球菌、模仿棒狀杆菌、藤黃(huáng)微球菌、痤瘡丙酸杆菌、人(rén)葡萄球菌、非發酵棒狀杆菌、緩症鏈球菌、球形馬拉色菌、限制(zhì)馬拉色菌、合軸馬拉色菌、塔賓曲黴等。
2. 陽性标準（僅供參考）
腦(nǎo)脊液樣本：
（1）對于細菌、真菌與寄生蟲，RPM（指每百萬序列的(de)特異性讀(dú)長比率，RPM=RPM 腦(nǎo)脊液/RPM 非模闆對照(zhào)）≥10，判斷爲陽性；
（2）對于病毒（DNA或RNA病毒），檢出讀(dú)長應至少(shǎo)覆蓋全基因組的(de) 3 個(gè)非重疊區域，判斷爲陽性[7]。
呼吸道樣本：
（1）細菌（分(fēn)枝杆菌除外）、真菌、病毒：病原種類的(de)相(xiàng)對豐度>30%，或某一病原培養陽性且mNGS序列數>50；
（2）結核分(fēn)枝杆菌：隻要有(yǒu)一條序列即可(kě)判斷陽性；
（3）有(yǒu)臨床其他(tā)試驗（病理(lǐ)、培養、塗片、抗原或抗體檢測、PCR）證明(míng)某 一微生物(wù)陽性時，mNGS鑒定的(de)該微生物(wù)被歸類爲确認病原體；
（4）如(rú)果僅有(yǒu)mNGS檢測出的(de)傳染性病原體，而沒有(yǒu)其他(tā)任何臨床試驗驗證，則此微生物(wù)被認爲是潛在的(de)病原體。所有(yǒu)經mNGS鑒定檢出但(dàn)不符合mNGS 陽性結果标準的(de)微生物(wù)都(dōu)被認爲是不确定病原體[8-10]。
血液樣本：
（1）明(míng)确感染（definite）：mNGS檢測的(de)病原結果與其他(tā)微生物(wù)檢測方法結果一緻（同一樣本檢測期限爲7天）；
（2）臨床診斷（probable）：根據臨床、放(fàng)射學或實驗室檢查結果，測序病原體結果被認爲是膿毒症預警的(de)可(kě)能(néng)原因；
（3）拟診（possible）：病原結果具有(yǒu)與臨床表現一緻的(de)潛在緻病性，但(dàn)對症狀的(de)另一種解釋更有(yǒu)可(kě)能(néng)；
（4）不大(dà)可(kě)能(néng)（unlikly）：結果與臨床表現不一緻[11]。
共識（阈值）：
（1）一般細菌：mNGS檢測到(dào)某種細菌（種水(shuǐ)平）的(de)序列數是其餘所有(yǒu)細菌的(de)10倍以上(shàng)，有(yǒu)臨床意義；
（2）真菌：mNGS檢測到(dào)真菌（種水(shuǐ)平）的(de)序列數是其餘所有(yǒu)真菌的(de)５倍以上(shàng)，有(yǒu)臨床意義；
（3）MTB：爲明(míng)确緻病菌，環境污染的(de)可(kě)能(néng)小(xiǎo)。此外，因MTB爲胞内緻病菌，細胞外遊離(lí)DNA 少(shǎo)，且MTB核酸提取效率低，mNGS隻要檢測到(dào)１條屬水(shuǐ)平的(de)MTB複合群序列，且能(néng)排除其他(tā)标本攜帶污染，就有(yǒu)臨床意義；
（4）非結核分(fēn)枝杆菌：可(kě)能(néng)是環境中污染菌，若檢出， 需結合背景微生物(wù)庫和(hé)mNGS原始細菌列表進行(xíng)結果判讀(dú)。若排除污染後屬水(shuǐ)平或種水(shuǐ)平序列數排名前十，則有(yǒu)臨床意義[12]。
3. 報告解讀(dú)常見錯誤
（1）Reads數最大(dà)，不一定是緻病病原體：
一項在13例耶氏肺孢子（PJP）感染病例中，mNGS檢出的(de)病原體reads數排名顯示，PJP不都(dōu)是排名第一，但(dàn)是确是緻病病原體。所以，mNGS檢出病原體reads數的(de)大(dà)小(xiǎo)不一定決定緻病的(de)情況[7]。
（2）“被扔掉的(de)數據”，不一定沒有(yǒu)用(yòng)（病例源自微信公衆号“呼吸界”）：
因此，在報告解讀(dú)時，需要注意檢出的(de)疑似微生物(wù)列表，因爲這也(yě)可(kě)能(néng)就是導緻病人(rén)緻病的(de)主要原因。
（3）“不常見”的(de)菌，不一定沒有(yǒu)意義（病例源自微信公衆号“呼吸界”）：
結論：這個(gè)病人(rén)爲女(nǚ)性同性戀，所以，我們在遇到(dào)部位 “不常見” 病原檢出時，一定要大(dà)膽實踐，小(xiǎo)心求證。
總結：
（1）mNGS已經越來越多的(de)被臨床所熟知，我們臨床醫生需要對其做好一定的(de)了解，才能(néng)更好的(de)利用(yòng)好這個(gè)工(gōng)具，更好的(de)幫助臨床；
（2）mNGS檢測前（樣本類型及采集等）和(hé)檢測後（報告解讀(dú)）是我們臨床醫生可(kě)控部分(fēn)，盡可(kě)能(néng)的(de)去遵循“專家共識”，讓mNGS檢測更有(yǒu)意義；
（3）目前mNGS尚無公認的(de)陽性阈值标準，在一定情況下，我們可(kě)以用(yòng)已發表的(de)文(wén)獻數據作一定的(de)參考；
（4）感染性疾病病原診斷要以患者爲中心，臨床起主導作用(yòng)，最終還是要回到(dào)患者本身。所以，面對mNGS技術(shù)，我們臨床要大(dà)膽的(de)實踐，小(xiǎo)心的(de)求證。
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