摘要
高(gāo)通量測序技術(shù)在分(fēn)枝杆菌病領域中的(de)應用(yòng)日益普及，而在實際應用(yòng)過程中，臨床醫師(shī)對技術(shù)本身及如(rú)何合理(lǐ)應用(yòng)檢測結果仍存在很多疑問。本共識針對高(gāo)通量測序技術(shù)臨床應用(yòng)中存在的(de)突出問題，依據公開(kāi)發表的(de)研究數據和(hé)參與專家的(de)應用(yòng)經驗，經衆多專家討(tǎo)論形成，爲在分(fēn)枝杆菌病診斷過程中合理(lǐ)使用(yòng)高(gāo)通量測序技術(shù)提供參考。
高(gāo)通量測序（high-throughput sequencing）技術(shù)在感染性疾病病原學診斷及常見病原微生物(wù)的(de)耐藥診斷中優勢明(míng)顯，在分(fēn)枝杆菌病領域也(yě)得到(dào)越來越廣泛的(de)應用(yòng)，爲疑難分(fēn)枝杆菌病的(de)診斷、鑒别診斷和(hé)耐藥診斷提供了循證醫學證據。
然而在實際應用(yòng)過程中，臨床醫師(shī)存在諸多困惑。鑒于此，高(gāo)通量測序共識專家組針對高(gāo)通量測序技術(shù)臨床使用(yòng)過程中存在的(de)突出問題，撰寫了本共識，以期提高(gāo)該技術(shù)的(de)臨床應用(yòng)水(shuǐ)平，去僞存真，使這項先進的(de)檢驗技術(shù)得到(dào)科學合理(lǐ)的(de)應用(yòng)。
一、高(gāo)通量測序技術(shù)概況
高(gāo)通量測序技術(shù)泛指二代測序技術(shù)和(hé)第三代測序技術(shù)，目前已有(yǒu)多種用(yòng)于臨床感染性疾病的(de)病原微生物(wù)鑒定，尤其是當缺乏診斷線索時，鑒定病原微生物(wù)具有(yǒu)顯著優勢。依據檢測策略的(de)不同，其主要分(fēn)爲靶向測序、宏基因組學測序（mNGS）和(hé)全基因組測序（WGS）。
分(fēn)枝杆菌靶向測序技術(shù)是先通過靶向捕獲分(fēn)枝杆菌特異基因後再進行(xíng)高(gāo)通量測序，主要适用(yòng)于臨床懷疑分(fēn)枝杆菌感染的(de)患者，既有(yǒu)助于診斷結核病/非結核分(fēn)枝杆菌（NTM）病，又(yòu)可(kě)以檢測耐藥基因突變，從而精準指導臨床醫師(shī)用(yòng)藥。
2018 年，WHO 發布的(de)《應用(yòng)高(gāo)通量測序技術(shù)檢測耐藥結核病相(xiàng)關基因突變的(de)技術(shù)指導原則》重點關注了靶向測序技術(shù)用(yòng)于結核病耐藥診斷的(de)功能(néng)。mNGS 技術(shù)則是直接對标本中所有(yǒu)的(de)核酸進行(xíng)無偏倚檢測和(hé)序列分(fēn)析，相(xiàng)比分(fēn)枝杆菌靶向測序，mNGS 可(kě)檢測出種類繁多的(de)微生物(wù)，但(dàn)無法實現對結核分(fēn)枝杆菌耐藥基因的(de)全面檢測。
二、高(gāo)通量測序技術(shù)的(de)特點
二代測序技術(shù)近年來發展迅猛，具有(yǒu)通量高(gāo)、速度快的(de)優點，但(dàn)存在讀(dú)長較短，不利于後續生物(wù)信息學分(fēn)析的(de)缺點，且 PCR 擴增過程中 DNA 序列堿基的(de) G-C 偏好性會(huì)影響檢測的(de)準确性。
第三代測序技術(shù)也(yě)被稱爲單分(fēn)子測序技術(shù)，可(kě)實現對 DNA/RNA 分(fēn)子直接測序，且讀(dú)長較長，一般爲幾十甚至上(shàng)百 kb，測序通量高(gāo)，數據可(kě)實時讀(dú)取分(fēn)析，速度更快，在臨床的(de)應用(yòng)也(yě)越來越多。
大(dà)量研究數據表明(míng)二代測序技術(shù)和(hé)第三代測序技術(shù)各有(yǒu)所長：二代測序讀(dú)長短但(dàn)準确度高(gāo)；第三代測序讀(dú)長長但(dàn)單堿基準确性稍差。臨床應用(yòng)過程中應依據檢測的(de)主要目的(de)選擇适宜的(de)測序技術(shù)。
三、開(kāi)展高(gāo)通量測序的(de)臨床适應證和(hé)送檢時機
（一）應用(yòng)高(gāo)通量測序檢測分(fēn)枝杆菌的(de)适應證
靶向測序适用(yòng)于病原學陰性的(de)疑似肺結核、肺外結核、NTM 病的(de)診斷及鑒别診斷，也(yě)适用(yòng)于菌量豐富的(de)臨床标本或菌株的(de)耐藥基因突變檢測，或用(yòng)于分(fēn)枝杆菌耐藥的(de)診斷。美(měi)格醫學的(de) TBseq 檢測項目可(kě)檢測 46 種分(fēn)枝杆菌分(fēn)型及 19 種抗結核耐藥基因和(hé) 7 種抗非結核耐藥基因，助力臨床精準診療！
mNGS 适用(yòng)于病原學陰性的(de)疑似肺結核、肺外結核、NTM 病及其他(tā)病原體感染的(de)診斷及鑒别診斷。
（二）高(gāo)通量測序檢測分(fēn)枝杆菌病的(de)适宜送檢人(rén)群及時機
1. 靶向測序檢測的(de)适宜送檢人(rén)群及時機
① 疑似肺結核患者，具有(yǒu)典型的(de)肺部影像學改變伴有(yǒu)或不伴有(yǒu)結核病中毒症狀，常規的(de)痰标本抗酸杆菌塗片、培養和(hé) Gene Xpert 等分(fēn)子生物(wù)學檢查均報告陰性結果時，或是有(yǒu)些患者增加了支氣管肺泡灌洗液檢查後仍不能(néng)确診時。
② 疑似結核性胸膜炎患者，鑒于胸腔積液常規結核分(fēn)枝杆菌檢查陽性率低，可(kě)考慮盡早送檢。
③ 疑似肺外結核患者如(rú)結核性腦(nǎo)膜炎、淋巴結結核、骨關節結核、結核性心包炎、腎結核、腸結核等，肺外結核診斷較困難，對應的(de)臨床标本中的(de)分(fēn)枝杆菌含量較低，常規檢測靈敏度低，建議及早送檢。
④ 複治結核患者，經過正規抗結核治療但(dàn)效果不理(lǐ)想，且常規的(de)分(fēn)子生物(wù)學檢查均報告陰性結果，建議送檢以明(míng)确耐藥情況。
⑤ 疑似 NTM 病的(de)患者，即多次培養及分(fēn)子檢測結果陰性者，尤其是同期抗酸杆菌塗片檢查陽性的(de)患者，建議送檢。
⑥ 考慮爲多種藥物(wù)耐藥的(de)結核病或 NTM 病患者，建議及時送檢以進一步獲取多種藥物(wù)的(de)耐藥證據，此時推薦送檢菌量豐富的(de)臨床标本或菌株。
2. mNGS 檢測的(de)适宜送檢人(rén)群及時機
① 疑似肺結核、結核性胸膜炎患者，常規的(de)分(fēn)子生物(wù)學檢查均報告陰性結果，但(dàn)仍需考慮與其他(tā)感染性疾病相(xiàng)鑒别的(de)患者，建議送檢。
② 腦(nǎo)脊液常規檢查及生物(wù)化學檢查符合結核性腦(nǎo)膜炎的(de)特點，腦(nǎo)脊液常規的(de)分(fēn)子生物(wù)學檢查均報告陰性結果，且患者無法排除其他(tā)感染，建議盡早送檢。
③ 淋巴結、肺組織、腸黏膜組織等新鮮組織标本病理(lǐ)檢查發現肉芽腫性病理(lǐ)改變但(dàn)未查到(dào)結核相(xiàng)關證據，仍需考慮與其他(tā)疾病鑒别時，建議送檢組織标本。
四、标本的(de)采集、檢測、報告及實驗室質量控制(zhì)
臨床标本的(de)質量直接影響檢測結果。不同标本類型受定植菌影響的(de)程度不同，建議建立不同類型臨床标本的(de)标準操作程序，減少(shǎo)污染的(de)可(kě)能(néng)。
（一）知情同意
标本采集前主管醫師(shī)應向患者或其監護人(rén)或者委托人(rén)告知拟開(kāi)展檢測項目的(de)目的(de)、意義、優點和(hé)局限性、費用(yòng)等。在整個(gè)流程中，要注意保護患方的(de)個(gè)人(rén)隐私。
（二）标本采集
針對分(fēn)枝杆菌患者感染部位的(de)不同，采集的(de)标本類型主要包括痰液、誘導痰、支氣管肺泡灌洗液、胸腔積液、腦(nǎo)脊液、尿液、活檢新鮮組織、血液等。（詳情見原文(wén)）
（三）标本保存和(hé)運輸
标本采集後，應盡快送檢，建議用(yòng)冰袋低溫運輸。若運輸時間在 24~72h 内，建議幹冰運輸。若無法及時送檢，血液标本可(kě)置于 4℃ 冰箱保存，但(dàn)最長保存時間不得超過 7d。
（四）高(gāo)通量測序技術(shù)檢測的(de)操作流程
1. 樣本前處理(lǐ)
分(fēn)枝杆菌病患者的(de)标本具有(yǒu)潛在的(de)感染性，在樣本處理(lǐ)前需進行(xíng)滅活處理(lǐ)。通常樣本前處理(lǐ)主要涉及分(fēn)裝、研磨、破壁、離(lí)心、過濾和(hé)純化等步驟，分(fēn)枝杆菌細胞壁較厚且含有(yǒu)大(dà)量脂質，因此需要進行(xíng)破壁處理(lǐ)。
2. 核酸的(de)提取
核酸提取的(de)質量是決定高(gāo)通量序檢測成功的(de)關鍵，不同的(de)操作實驗室都(dōu)應建立完整的(de)核酸提取流程。
3. 文(wén)庫構建和(hé)基因測序
文(wén)庫制(zhì)備實驗流程包括 PCR 富集、添加接頭、末端修複、連接接頭、純化等流程，文(wén)庫質量直接影響測序的(de)數據質量。
目前，主流測序平台包括二代測序平台和(hé)第三代測序平台，二代測序的(de)數據量至少(shǎo)爲 2000 萬條（20 million，即 20M）高(gāo)質量序列，第三代納米孔的(de)數據量至少(shǎo)爲 50000 條高(gāo)質量序列。
４. 生物(wù)信息學分(fēn)析
該流程由多個(gè)軟件(jiàn)組成，包括去除人(rén)源序列、處理(lǐ)微生物(wù)序列及相(xiàng)關元數據、檢測目标序列，以及特定基因變異，實現檢測與數據的(de)轉換。
5. 質量控制(zhì)
實驗室在各個(gè)操作環節都(dōu)應進行(xíng)嚴格的(de)質量控制(zhì)。每批次樣本中應設置包括内參照(zhào)、陰性對照(zhào)品和(hé)陽性對照(zhào)品。每批次實驗均需評估是否存在操作或環境帶來的(de)污染風險。
（五）出具報告
病原體檢測報告需要符合《醫療機構臨床實驗室管理(lǐ)辦法》與《醫學檢驗實驗室基本标準和(hé)管理(lǐ)規範（試行(xíng)）》對檢測報告的(de)要求。檢測報告需要有(yǒu)嚴格的(de)發放(fàng)和(hé)審核流程，以确保報告的(de)及時性、有(yǒu)效性、準确性和(hé)完整性。
五、臨床結果判讀(dú)
分(fēn)枝杆菌病的(de)診斷需結合流行(xíng)病學史、臨床表現、影像學和(hé)實驗室檢查結果等綜合判斷。
陽性結果解讀(dú)需要關注：是否是常見的(de)緻病菌，臨床表現是否與其緻病性一緻，是否能(néng)與其他(tā)病原學結果相(xiàng)呼應。陰性結果具有(yǒu)一定排除感染的(de)價值，但(dàn)還需結合臨床進行(xíng)綜合判斷。
（一）結核病診斷
1. 不同标本類型的(de)診斷價值
臨床所有(yǒu)類型的(de)标本均可(kě)開(kāi)展高(gāo)通量測序檢測，但(dàn)不同類型标本由于其自身特點的(de)不同，由其衍生出的(de)高(gāo)通量測序數據的(de)診斷價值會(huì)存在差異。（詳情見原文(wén)）
2. 陽性阈值及判讀(dú)标準
建立高(gāo)通量測序病原體診斷阈值的(de)影響因素較多，包括測序平台、測序流程、标本類型、病原體種類、患者狀況，目前尚無統一公認的(de)阈值。
① mNGS 陽性阈值設定原則及判讀(dú)标準：《宏基因組高(gāo)通量測序技術(shù)應用(yòng)于感染性疾病病原檢測中國專家共識》建議，結核分(fēn)枝杆菌檢出 1 條特異性序列即可(kě)判定爲陽性。鑒于檢測的(de)複雜性，本共識建議對獲得個(gè)位數的(de)序列需先審核當前批次檢測中有(yǒu)無其他(tā)獲得大(dà)量序列支持結核病診斷的(de)标本。
② 靶向測序陽性阈值設定原則及判斷标準：特異性序列大(dà)于 100 條序列，且非單一靶點序列，可(kě)推薦作爲陽性阈值判定标準；特異性數據小(xiǎo)于 100 條序列，特别是同批次有(yǒu)獲得大(dà)量序列數支持結核病診斷的(de)标本時，需行(xíng)其他(tā)方法學進行(xíng)佐證，可(kě)進行(xíng)實時熒光(guāng)定量 PCR 确認。特異性數據小(xiǎo)于 10 條序列時，尤當慎重判讀(dú)，建議考慮另留取一份樣本進行(xíng)檢測以佐證本次檢測結果。
如(rú)重複樣本獲得陽性結果，無論序列數如(rú)何，都(dōu)應首先考慮其結核病診斷；如(rú)果複測結果爲陰性，則暫不考慮其結核病診斷。
（二）NTM 病診斷
高(gāo)通量測序檢測到(dào) NTM 與結核分(fēn)枝杆菌的(de)核酸存在明(míng)顯不同的(de)價值，這種不同主要是因爲 NTM 并非像結核分(fēn)枝杆菌一樣屬于絕對緻病菌。
除了海(hǎi)分(fēn)枝杆菌和(hé)潰瘍分(fēn)枝杆菌外，NTM 都(dōu)屬于機會(huì)緻病菌，可(kě)在機體中定植而不引起疾病，因此需要依照(zhào)指南推薦的(de)判斷标準，仔細辨别其是否是引起感染的(de)病原菌。
1. 高(gāo)通量測序檢測結果回報爲常見的(de)緻病性 NTM 菌種
我國常見的(de) NTM 菌種中，臨床相(xiàng)關性較好的(de)有(yǒu)胞内分(fēn)枝杆菌、堪薩斯分(fēn)枝杆菌和(hé)膿腫分(fēn)枝杆菌，其次是鳥分(fēn)枝杆菌。高(gāo)通量測序檢測陽性等同于 1 次分(fēn)子檢測陽性，因此需要至少(shǎo)再有(yǒu) 1 份标本的(de)檢測鑒定結果爲同一菌種時才可(kě)考慮其臨床意義。（詳情見原文(wén)）
（三）分(fēn)枝杆菌病的(de)耐藥診斷
1. 高(gāo)通量測序技術(shù)對耐藥分(fēn)枝杆菌病的(de)診斷價值
mNGS 技術(shù)通常無法獲得足夠的(de)結核分(fēn)枝杆菌/NTM 的(de)核酸序列信息，因此不用(yòng)于分(fēn)枝杆菌耐藥的(de)診斷。
靶向測序通過特定的(de)捕獲技術(shù)對标本中結核分(fēn)枝杆菌/NTM 核酸及耐藥基因進行(xíng)富集，以提高(gāo)核酸濃度，獲得更多的(de)數據信息。當臨床标本中菌含量豐富時，能(néng)捕獲到(dào)數量較多的(de)不同耐藥基因的(de)序列，從而進行(xíng)耐藥的(de)分(fēn)子診斷。
2. 耐藥基因陽性阈值及判斷标準
目前針對臨床标本靶向測序檢測分(fēn)枝杆菌耐藥的(de)判定缺乏統一的(de)标準。在判讀(dú)時，應參考突變發生位點、測序深度及突變頻率綜合判斷。六、結語
随著(zhe)高(gāo)通量測序技術(shù)的(de)持續優化、臨床應用(yòng)經驗的(de)不斷積累和(hé)臨床數據的(de)快速增加，對高(gāo)通量測序技術(shù)用(yòng)于菌陰肺結核、肺外結核和(hé) NTM 病的(de)診斷及耐藥診斷價值的(de)認知會(huì)逐漸深入。希望本共識能(néng)夠在現階段幫助臨床醫師(shī)科學、合理(lǐ)地(dì)應用(yòng)高(gāo)通量測序技術(shù)診斷分(fēn)枝杆菌病。
